羊毛织物的固定化溶菌酶抗菌整理

羊毛织物的固定化溶菌酶抗菌整理rz-081031-5

胡英俊, 范雪荣, 王强, 王平, 崔莉江南大学生态纺织教育部重点实验室,江苏无锡214122

收稿日期: 2008-02-7;修回日期: 2008-04-7

基金项目:国家“863”项目(2007AA02Z218)。

作者简介:胡英俊(1985-),女,江南大学在读硕士研究生。主要从事纺织品生态加工技术研究。

原载：印染2008/9；8-10

网上来稿：zhanyizhen，2008/10/31

【摘要】将固定化溶菌酶用于羊毛织物的抗菌整理。探讨了酶固定化的主要工艺条件,得出优化参数,即戊二醛浓度0.2%,固定化pH值7.0,固定化时间6h,酶用量5 g/L。结果表明,在此工艺条件下整理的羊毛织物对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到80.95%,具有良好的抗菌效果。

【关键词】抗微生物整理; 酶; 毛织物

【中图分类号】195. 58　　文献标识码: A　　文章编号: 1000-4017(2008)09-0008-03

0　前言

近年来,羊毛织物的抗菌整理主要采用无机、有机和天然三大类整理剂[1]。无机类大多为金属离子抗菌剂,其机理是离子缓释抗菌[2]。即在使用过程中,抗菌活性离子缓慢释放,依靠金属离子与细菌细胞膜或与细菌酶蛋白的巯基等基团结合破坏酶的活性,从而发挥抗菌作用。但金属离子抗菌剂大多为Hg、Ag等重金属离子,会从纤维表面释放出来,并通过与皮肤接触,渗入体内,对人体危害较大。另外,无机抗菌剂虽有良好的抗菌性能,但因其不能与纤维牢固结合、不耐水洗,而被逐渐淘汰。有机抗菌剂主要组分为季铵盐类、醇类和双胍类等含有反应性官能团的化合物[3]。抗菌机理是破坏细胞膜、使蛋白质变性和代谢受阻等,具有见效快,杀菌力强的特点,但易产生微生物抗药性,并存在作用期短、耐热性差和产生二次污染等缺点。天然抗菌剂来自天然提取物,如壳聚糖、日柏醇等,其主要抗菌机理被认为与有机季铵盐类似,但效果不如有机抗菌剂,且产品尚不成熟。

溶菌酶(Lysozyme),又称细胞壁质酶(Muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-Acetyl muramide Glycanohydralase)[4],广泛分布于动物、植物和微生物中。该酶是专门作用于微生物细胞壁的水解酶,能有效水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸(NAM)的l位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的β-l,4糖苷键,使细菌细胞壁变得松弛,失去对细胞的保护作用,最终导致细胞溶解死亡[5～7]。因此,溶菌酶作为天然的防腐抗菌剂,具有抗菌性强、安全无毒、热稳定性好和作用范围广等优点,而在食品、医药、生物工程和化妆品等行业广泛应用[7]。基于溶菌酶以上特点,若将其固定于纺织品表面,有望建立一种新型的纺织品抗菌方法,拓展生物酶在纺织品中的应用。本试验拟通过戊二醛的交联作用[8,9],将溶菌酶固定在羊毛纤维上,从而赋予羊毛纤维优良的抗菌效果;并通过测试整理后羊毛织物的抗菌性能,分析影响酶固定化的几个重要因素,得出最佳工艺条件。

1　试验

1. 1　材料与仪器

织物　羊毛织物(全毛华达呢,220g/m2 ,无锡协新毛纺厂)

试剂　溶菌酶(工业品,酶活12000 U/mg) ,微球菌粉(南京建成生物工程研究所),25%戊二醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、醋酸钠、醋酸、甘氨酸、氢氧化钠(均为分析纯) 。

仪器　UV22802S型紫外-可见分光光度计, PHS-2C型酸度计,WHYF-2F型全封闭水浴恒温振荡器。

1. 2　羊毛织物预处理

采用H2O2(30%)对羊毛织物进行氧化预处理。

工艺处方(g/L)

H2O2 (mL/L) 　　　　　　40

Na2SiO3 3.5

JFC 1.0

pH值 8～8.5

浴比 1∶50

温度℃ 50

时间min 35

氧化预处理后用去离子水充分洗涤,晾干备用。

1. 3　溶菌酶固定化

将羊毛织物剪成直径为1cm的小圆片试样,浸渍于0.2%戊二醛溶液中,于25℃水浴恒温振荡器中低速振荡6h;取出,用去离子水充分洗涤3～4次;再置于5g/L溶菌酶缓冲溶液(pH值7.0)中,于4℃反应9h,取出;用去离子水充分洗涤,低温风干,置于4℃的冰箱中贮存备用。

1. 4　溶菌酶活力的测定

1. 4. 1　游离酶活力测定

采用改进的舒加(Shugar)法测定游离酶的酶活[10～12]:

溶菌酶活力(U/mg)=	ΔOD450
	0. 001样品量

式中:ΔOD450 ———微球菌液在450nm处15s时与75s

时的吸光值之差;

样品量 ——— 每0.5mL酶液中溶菌酶毫克数。

1. 4. 2　固定化酶活力测定[13]

固定化溶菌酶活力(U/cm2 ) =	ΔOD450 ×1000
	S

式中:ΔOD450 ——— 450nm处微球菌液每分钟吸光度的变化;

S ——— 加入羊毛织物的面积(cm2) 。

1. 5　抗菌评价标准

样品的抗菌性能通过抑菌率进行评价[14],按下式计算抑菌率(XS):

XS =	A - B
	B

式中: XS ——— 抑菌率(%);

A ——— 样品振荡前平均菌落数;

B ——— 样品振荡后平均菌落数。

选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准,该范围的稀释度乘以稀释倍数就是菌落总数。如果振荡后的平均菌落数大于振荡前的平均菌落数,抑菌率按0计算。不加样片组的菌落数在1×104～9×104 cfu/mL之间,且样品振荡前后平均菌落数差值在10%以内,试验有效;若被试样片组抑菌率与对照样片组抑菌率的差值＞26% ,则产品具有抗菌作用。

2　结果与讨论

2. 1　戊二醛浓度对溶菌酶固定化的影响

戊二醛是双官能团试剂,分子一端的醛基可以与羊毛载体上的氨基反应,另一端的醛基可与酶分子上的氨基发生反应,从而实现酶分子的化学交联固定。戊二醛浓度对溶菌酶在羊毛织物上的固定化效果有至关重要的作用,其对羊毛织物固定化酶活力的影响如图1所示。

图1　戊二醛浓度对固定化酶活力的影响

由图1可知,当戊二醛浓度低于0.2%时,固定化酶活力随戊二醛浓度增加而增大;当戊二醛浓度范围在0.2%～2.0%时,固定化酶活力随戊二醛浓度增加而减小。这是因为随着戊二醛浓度增加,羊毛纤维中被活化的氨基数量不断增加,相应的溶菌酶结合位点(醛基)不断增加,因而固定化酶量也增加,表现出固定化酶活力增大;但当戊二醛浓度过大时,活化的羊毛表面过多的活性醛基会导致酶分子与羊毛载体间形成多点结合,产生大面积的空间位阻,使酶分子的活性中心不易与底物分子接触, 导致固定化酶的活力下降[15]。图1表明,戊二醛最佳浓度为0.2%。

2. 2　固定化pH值对溶菌酶固定化的影响

羊毛织物与戊二醛交联后,表面引入了醛基,醛基可与酶分子的氨基进一步发生反应,从而实现酶分子在羊毛载体上的化学交联固定。在试验过程中,固定化pH值对固定化酶活力的影响如图2所示。

图2　固定化pH值对固定化酶活力的影响

由图2可知,当pH值为7.0时,固定化酶活达到最大值。pH值过高或过低,酶活均下降。因为在溶菌酶固定化反应过程中, pH值可以改变羊毛纤维的带电状态,使羊毛纤维与溶菌酶接触的微环境发生变化;同时,溶菌酶作为一种蛋白质,其带电状态与构象也受pH值的影响,当溶液的pH值超出一定范围时(溶菌酶的最适pH值为4～6.5) ,会引起酶变性失活。图2表明,选择固定化pH值7.0为宜。

2. 3　游离酶用量对溶菌酶固定化的影响

游离酶用量对羊毛织物固定化酶活力的影响如图3所示。

图3　游离酶用量对固定化酶活力的影响

由图3可知,随着游离酶用量增加,固定化酶活力不断上升,游离酶用量为5g/L时达到最大值。这说明单位载体给酶量越多,载体上偶联的酶蛋白质就越多,载体与溶菌酶分子结合越充分,相应的固定化酶活力就越高。但是载体上溶菌酶分子的结合位点(醛基)是有限的,所以随酶用量增加,固定化酶活没有相应的增加,而是趋向平衡。图3表明,取溶菌酶用量为5g/L。

2. 4　固定化时间对溶菌酶固定化的影响

羊毛织物固定化酶活力随固定化时间变化的趋势如图4所示。

图4　固定化时间对固定化酶活力的影响

从图4可知,固定化时间为6 h时,酶活达到最大值。固定化时间小于6h,交联反应不够充分,酶结合有限;超过6h,随固定化时间增加,固定化酶活力反而下降,可能是由于时间过长,部分酶失活。因此,交联固定时间以6h为宜。

2. 5　抗菌效果测试

采用振荡烧瓶法对最佳工艺条件下固定溶菌酶的羊毛织物进行抗菌性能测试,试验菌种为金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌代表,ATCC6538,Staphylococcusaureus)。试验现象及结果见图5和表1。

图5　羊毛织物抗金黄色葡萄球菌测试现象

0-0时间接触菌液;菌-振荡12h后的菌液; 1-未经任何处理的羊毛织物; 2-溶菌酶固定化的羊毛织物

表1　经溶菌酶固定的羊毛织物抗金黄色葡萄球菌测试结果

项目	稀释液及菌落数				菌落总数	抑菌率%
项目	10	10²	10³	10⁴	菌落总数	抑菌率%
0时间接触菌液	多不可计	210	19	2	21000	-
振荡12 h后的菌液	多不可计	219	27	1	21900	-
未处理	多不可计	244	29	3	24400	0
溶菌酶固定化	多不可计	40	5	0	4000	80.95

　　由图5和表1可知,溶菌酶经戊二醛交联固定在羊毛织物上,羊毛织物具有良好的抗菌效果,对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到80.95% ,远远大于26%。

3　结论

固定化溶菌酶用于羊毛织物的抗菌整理,其优化的工艺条件为:戊二醛浓度0.2%,固定化pH值7.0,固定化时间6h,酶用量5g/L。溶菌酶经戊二醛交联固定在羊毛织物上,使羊毛织物具有良好的抗菌效果,对金黄色葡萄球菌的抑菌率可达到80.95%。

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