羊毛角蛋白酶、蛋白酶防毡缩加工9-25
王平1 范雪荣1 蔡成岗2 王强1 崔莉1
1．生态纺织教育部重点实验室（江南大学）
2. 浙江树人大学生物与环境工程学院
原载：第九届全国染整前处理学术讨论会论文集；223-229
【摘要】为提高羊毛酶法防毡缩整理效果，采用一种枯草芽孢菌产角蛋白酶和Savinase蛋白酶进行了羊毛酶处理实验，考察了二步法协同处理对羊毛减量效果的影响。研究结果表明，单一角蛋白酶对羊毛减量效果较低，但能促进后续蛋白酶处理效率的提高。与氧化和蛋白酶处理相结合的防毡缩方法相比，经角蛋白酶、蛋白酶二步处理后毛织物的减量率与毡缩率略低，润湿性与染色性能有所改善，纤维损伤较少。羊毛氨基酸分析结果表明，角蛋白酶、蛋白酶处理后毛纤维中胱氨酸相对质量浓度低于氧化与蛋白酶处理样，验证了角蛋白酶能促使鳞片层中胱氨酸残基二硫键还原与蛋白变性，利于后续蛋白酶加工中毛纤维表面鳞片蛋白水解。
【关键词】羊毛；角蛋白酶；Savinase蛋白酶；氧化；毡缩率
羊毛纤维最外层是鳞片层，由部分角质化的扁平状细胞通过细胞膜复合物（CMC）粘接而成。 其中鳞片表层主要由憎水性类脂物与胱氨酸（Cys）等氨基酸形成的蛋白质组成；外层主要由角质化蛋白质构成，胱氨酸残基含量很高，结构坚硬难以被膨化，是羊毛鳞片的主要部分，使毛纤维具有化学稳定性与毡缩性。借助于氯化、氧化或还原处理能破坏鳞片疏水性类脂层连续分布状态，部分切断鳞片层中部分胱氨酸二硫键（-S-S-）键，松解纤维鳞片表面紧密结构，提高毛纤维表面的反应性与抗毡缩性。但化学处理过程中若工艺控制不当，极易造成处理不匀和纤维损伤，使羊毛织物服用性下降。以生物酶进行羊毛处理加工，提高羊毛鳞片层去除效果已有报道，包括应用脂肪酶部分水解去除羊毛纤维鳞片外层的类脂物，增加纤维表面亲水性与后续纤维表面蛋白酶酶解效果等［1-2］。Hutchinson等人［3］的研究结果表明脂肪酶对羊毛纤维表面润湿性改进效果不明显。前期研究表明角质酶能降低毛纤维表面接触角，但对鳞片层中的二硫键影响较小，羊毛鳞片层的酶解效率有待提高［4］。
角蛋白酶为专一性降解角蛋白的一类酶，在食品、饲料和制革等工业中广泛应用［5-6］。尽管不同来源的角蛋白酶其作用机理可能不完全相同，但多数被认为其本身具有一定的二硫键还原活性［7-8］，可促进不同角蛋白分子结构的解体，形成变性角蛋白。羊毛作为产品附加值较高的天然纤维，纤维鳞片层富含高度交联的胱氨酸二硫键，采用角蛋白酶、蛋白酶进行羊毛协同处理具有潜在的应用效果，可提高天然毛纤维的产品附加值。本文应用一种枯草芽孢菌产角蛋白酶进行了羊毛酶法预处理试验，旨在借助于角蛋白酶对羊毛鳞片层中二硫键还原作用，提高后续羊毛蛋白酶处理中鳞片层的去除效果。
1 试 验
1.1 材 料
纯毛华达呢（
1.2 试验方法
角蛋白酶预处理：羊毛织物经
羊毛氧化预处理：H2O2（30%）5 mL/L，焦磷酸钠
蛋白酶处理：不同预处理后试样以2.0%（o.w.f）Savinase蛋白酶在
根据织物回潮率，计算出试样经角蛋白酶或蛋白酶处理前的恒定干重；准确称量蛋白酶处理后织物的恒定干重，按下式计算织物蛋白酶处理前后的减量率。
参照AATCC 39-1980，记录20 μL去离子水在织物表面不同位置被完全吸收所需时间（min）；使用DAS100液滴形状分析仪（Olympus，日本），记录20 μL去离子水滴至织物上10 s时水滴在织物表面所形成的接触角，测试多点求平均值。
参照IWTO 4-60测试方法，分别测定空白羊毛试样、角蛋白酶处理样、氧化处理样及蛋白酶处理试样碱溶解度，评价处理中羊毛纤维损伤大小。
参照IWS TM 31测定方法，应用Y（B）
采用弱酸艳蓝RAWL
2.0%（o.w.f）在pH=6.0、浴比1∶100条件下染色，室温入染后以
将不同羊毛纤维处理试样，用6
mol/L的HCl在
2 结果与讨论
2.1 角蛋白酶用量与处理时间对减量率影响
实验中考察了仅角蛋白酶处理、角蛋白酶和蛋白酶二浴处理过程中角蛋白酶用量和处理时间变化对毛织物减量率的影响，结果见表1、2。
表1 角蛋白酶用量对羊毛酶处理后减量率影响
|
角蛋白酶用量/ %（o.w.f） |
角蛋白酶处理样 /% |
角蛋白酶+蛋白酶 处理样/% |
|
0 |
0.30 |
2.54 |
|
10 |
0.36 |
3.11 |
|
20 |
0.40 |
3.59 |
|
40 |
0.52 |
3.69 |
|
100 |
0.46 |
3.67 |
*角蛋白酶处理时间为6 h。
表2 角蛋白酶预处理时间对羊毛酶处理后减量率影响
|
2 |
0.20 |
2.70 |
|
4 |
0.36 |
3.05 |
|
6 |
0.40 |
3.59 |
|
12 |
0.38 |
3.52 |
|
24 |
0.48 |
3.71 |
*角蛋白酶用量20 %（o.w.f）。
表1中仅经角蛋白酶处理，羊毛织物减量率变化较少，不同用量角蛋白酶下处理后减量率极差不到0.30%。经蛋白酶二步法处理后，不同试样的减量率表现出一定的差异，数值随角蛋白酶用量增加而增加并趋于稳定。表2中仅经角蛋白酶处理试样在不同时间处理后减量率数据均较低，蛋白酶处理后表现出一定的差异，总体上随预处理时间延长而增加并趋于稳定。
仅经角蛋白酶处理，羊毛试样减量率变化较少的原因可能有二方面。其一，角蛋白酶酶活较低或对羊毛角蛋白的专一性不够，预处理中表现为角蛋白酶解效率较低。其二，角蛋白酶羊毛预处理过程作用机制以变性作用为主，而水解作用或转氨基作用较弱。所谓变性作用是指当羊毛鳞片层中稳定的二硫键被破坏后，角蛋白丧失不溶性和抗酶解能力的过程；水解和转氨基作用是指只有当角蛋白变性后角蛋白才能水解，进一步降解为可溶性多肽和氨基酸［10］。羊毛角蛋白酶预处理过程中部分鳞片层二硫键被还原，但由于变性蛋白质尚未进一步水解，因此预处理后羊毛减量率较低；后续蛋白酶处理中，蛋白酶分子可借助于部分还原打开的二硫键通道向纤维鳞片内扩散，促进了酶解反应效率的提高，因此角蛋白酶预处理、蛋白酶二步处理后纤维的减量率较空白样略有增加。
2.2 角蛋白酶用量与处理时间对润湿性影响
羊毛纤维表面被憎水性类脂层包裹的鳞片结构覆盖，测定织物表面润湿性可了解纤维类脂层及鳞片结构破坏程度。角蛋白酶预处理、蛋白酶处理后试样的润湿时间与表面接触角结果见表3、4。
表3 角蛋白酶用量对羊毛织物酶处理后润湿性影响
|
角蛋白酶用量/%（o.w.f） |
角蛋白酶处理样 |
|
角蛋白酶+蛋白酶 |
||
|
润湿时间/min |
接触角 /o |
|
润湿时间/min |
接触角 /o |
|
|
0 |
>30 |
131 |
|
24.8 |
123 |
|
10 |
>30 |
126 |
|
22.2 |
113 |
|
20 |
>30 |
115 |
|
18.5 |
106 |
|
40 |
23 |
112 |
|
15.7 |
100 |
|
100 |
>30 |
120 |
|
16.8 |
98 |
*角蛋白酶处理时间为6 h。
表4 角蛋白酶预处理时间对酶处理羊毛织物润湿性影响
|
处理时间/h |
角蛋白酶处理样 |
|
角蛋白酶+蛋白酶 |
||
|
润湿时间/min |
接触角/o |
|
润湿时间/min |
接触角/o |
|
|
2 |
>30 |
129 |
|
25.5 |
124 |
|
4 |
>30 |
119 |
|
24.0 |
116 |
|
6 |
>30 |
115 |
|
18.5 |
106 |
|
12 |
>30 |
112 |
|
16.5 |
108 |
|
24 |
>30 |
97 |
|
17.2 |
96 |
*角蛋白酶用量20 %（o.w.f）。
表3、4中仅经角蛋白酶处理样润湿性随角蛋白酶浓度变化和处理时间延长改善较少。预处理过程中尽管鳞片层中部分-S-S-可能被还原成亲水性-SH或-SSO3-［10-11］，由于没有明显的蛋白大分子肽链的水解，纤维表面疏水性类脂物并没有得到有效去除，因此羊毛试样表面仍具有较强的拒水性。此现象与我们前期研究过的过氧化氢羊毛预处理相似，过氧化氢能虽然破坏纤维的二硫键，但仅经过氧化氢处理纤维表面润湿性改进也较小［4］。
蛋白酶处理可增加毛纤维亲水性-NH3+与-COO-的数量，部分类脂物随毛纤维鳞片层蛋白水解而从鳞片表层有效剥离，提高了羊毛试样表面的亲水性。表3、4中不同条件下预处理后的羊毛试样经蛋白酶处理后润湿性表现出一定的差异，随着角蛋白酶浓度增加与处理时间延长，润湿时间与接触角呈下降的趋势。这是由于角蛋白酶预处理促进了蛋白酶酶解效果，随着鳞片外层高度交联蛋白结构的松解与水解，鳞片表层的疏水性类脂物随之得到部分剥离。
2.3 角蛋白酶处理对碱溶解度与毡缩性影响
羊毛在蛋白酶减量处理过程中，纤维鳞片层会被部分水解和去除的同时，部分细胞膜复合物及皮质层组分也会被酶解［12-13］。测定羊毛试样的碱溶解度可了解毛纤维处理中的损伤大小。实验中考察了角蛋白酶预处理样的碱溶解度与毛织物毡缩率，并与基于氧化预处理的羊毛蛋白酶处理样进行了对比，结果见表5。
表5 角蛋白酶与氧化预处理后的蛋白酶羊毛处理样碱溶解度与毡缩率
|
处理条件 |
失重率/% |
碱溶解度/% |
毡缩率/% |
|
空白 |
/ |
11.3 |
10.5 |
|
角蛋白酶 |
0.40 |
11.2 |
10.3 |
|
氧化 |
0.45 |
11.9 |
11.2 |
|
蛋白酶 |
2.54 |
13.8 |
7.3 |
|
角蛋白酶+蛋白酶 |
3.59 |
13.9 |
6.0 |
|
氧化+蛋白酶 |
4.10 |
16.2 |
6.8 |
*角蛋白酶用量20 %（o.w.f），处理时间6 h。
表5中未经蛋白酶处理样的碱溶解度差异较小，失重率也较接近。蛋白酶处理后减量率和碱溶解度有所增加，表明处理中纤维不同程度地受到损伤。与仅经蛋白酶处理样相比，角蛋白酶、蛋白酶二步法处理样减量率略高，碱溶解度相近，表明角蛋白酶预处理削弱了蛋白酶对鳞片层胞间质和内部皮质层的作用，促进了纤维鳞片外层蛋白的酶解反应，在获得鳞片层水解去除效果的同时，纤维内部损伤增加较少。与氧化、蛋白酶二步法处理羊毛试样相比，角蛋白酶、蛋白酶处理样减量率略低，纤维损伤也较小，这是由于氧化预处理过程中过氧化氢在氧化部分二硫键的同时，还会扩散进入纤维鳞片层内部，增加了蛋白酶处理中纤维内部组分的水解与损伤。因此，角蛋白酶应用于羊毛酶处理，不但可适度提高蛋白酶酶解效率，且对纤维损伤也较化学法预处理小。
表5中仅经角蛋白酶处理羊毛试样毡缩性没有改进，仅过氧化氢预处理纤维表面粗糙度增加，毛织物毡缩略有增加。经蛋白酶处理后，试样的毡缩率均有不同程度的下降，其中经角蛋白酶和蛋白酶处理具有稍低的毡缩率，表明纤维表面的鳞片得到较多去除。
2.4 角蛋白酶处理对织物染色性能影响
羊毛蛋白酶处理后纤维表面的类脂物和鳞片结构减少，纤维的染色性能会发生变化。实验中应用弱酸艳蓝RAWL考察了不同条件下处理后羊毛试样的染色性能，结果见表6。
表6 角蛋白酶与氧化预处理的羊毛蛋白酶处理后染色性能
|
处理条件 |
上染率/% |
K/S |
|
空白 |
35.7 |
14.4 |
|
角蛋白酶 |
31.7 |
12.5 |
|
氧化 |
13.9 |
9.6 |
|
蛋白酶 |
43.9 |
19.7 |
|
角蛋白酶+蛋白酶 |
42.3 |
19.5 |
|
氧化+蛋白酶 |
19.5 |
11.7 |
*角蛋白酶用量20 %（o.w.f），处理时间6 h。
表6中角蛋白酶和氧化预处理对纤维染色性能没有改进，上染百分率与染色深度较原样有所下降。单一角蛋白酶预处理对纤维的减量效果较小，还原产生的-SH或-SSO3-等基团，降低了染料阴离子（D-SO3-或D-COO-）在纤维表面的吸附量，使得染色深度降低。同样，单一氧化预处理未引起纤维失重，氧化产生的负电性基团使织物对弱酸性染料阴离子的库仑斥力增加，因此上染率与染色深度发生下降。
蛋白酶处理可使纤维表面的鳞片层部分水解或剥离，染料吸附与扩散速率增加。表6中蛋白酶处理后试样上染百分率与染色深度均有所提高。 其中，角蛋白酶预处理促进了后续蛋白酶分子对纤维鳞片表面蛋白的水解，二步法处理后试样染色性能也趋于与仅蛋白酶处理样一致。尽管表5中经氧化和蛋白酶处理样减量率较高，但表6中相应试样染色深度K/S较低，表明处理后毛纤维内部可能仍有较多负电性基团，验证了氧化预处理对毛纤维鳞片及内部产生了作用。
2.5 不同酶处理残液氨基酸分析
羊毛纤维鳞片外层中胱氨酸（Cys）含量很高 ［14-15］。考察不同条件下处理后羊毛的胱氨酸含量，可了解纤维酶处理后鳞片总体去除效果。表7中列出了不同条件下处理后羊毛纤维酸水解产物中胱氨酸的相对质量百分率。
表7 角蛋白酶与氧化预处理羊毛蛋白酶处理后纤维胱氨酸相对质量浓度
|
处理条件 |
胱氨酸/% |
|
空白 |
7.08 |
|
角蛋白酶 |
6.98 |
|
氧化 |
7.11 |
|
蛋白酶 |
7.26 |
|
角蛋白酶+蛋白酶 |
6.21 |
|
氧化+蛋白酶 |
6.87 |
*角蛋白酶用量20 %（o.w.f），处理时间6 h。
与空白样相比，表7中角蛋白酶和氧化预处理后毛纤维中胱氨酸相对含量变化较少，这是由于两者对纤维减量效果较小。仅蛋白酶处理的羊毛试样，胱氨酸浓度略有上升，这是由于未经预处理毛纤维表面疏水性较强，交联程度较高，蛋白酶处理倾向于纤维细胞膜复合物水解，鳞片层中胱氨酸浓度变化较少，随着减量率的增加，毛纤维中胱氨酸的相对浓度有所增加。在角蛋白酶与氧化预处理基础上，经蛋白酶处理后毛纤维中胱氨酸相对浓度有所下降，表明羊毛鳞片层蛋白得到了有效水解。尽管氧化、蛋白酶二步法处理试样减量率较高（表5），但纤维水解液中胱氨酸浓度仍高于角蛋白酶与蛋白酶二步法处理样（表7），验证了角蛋白酶与蛋白酶应用可提高羊毛纤维表面鳞片去除效果。
3 结 论
1）Bacillus subtilis菌产角蛋白酶处理能增加羊毛纤维鳞片层二硫键的还原，促进了后续蛋白酶水解效率的提高。在相同蛋白酶处理条件下，经角蛋白酶预处理试样润湿性略有改善，纤维表面亲水性基团数量增加。
2）与传统氧化与蛋白酶相结合的羊毛生物减量加工相比，角蛋白酶、蛋白酶二步法处理引起的羊毛纤维损伤较低，获得稍低的毡缩率。
3）氨基酸分析表明基于角蛋白酶和蛋白酶处理羊毛纤维具有较低的胱氨酸（Cys）浓度，验证了角蛋白酶与蛋白酶处理对毛纤维鳞片层的去除具有一定协同作用。
参考文献：
李 江，姚斌，范云六. 微生物角蛋白酶的分子生物学研究进展 ［J］. 工业微生物，2006，36（3）：37-42.等