用于丝绸制品生物抑菌材料的研究yd18834
章向阳，陈良 博约生物科技(苏州)有限公司，江苏苏州215123
收稿日期：2015-05-29
*基金项目：苏州市2012年科技发展计划——植物胶纳米技术及抑菌丝绸制品研究IZXS2012011)
原载：现代丝绸科学与技术2015/4；133-136
【摘要】研究了能抑制丝绸制品霉菌和细菌生长且对人体无毒害的生物抑菌材料的组成。研究表明：由辣木籽、苦参、黄芩、黄柏、地肤子、蛇床子、土槿皮、山银花、茯苓复配而成的生物抑菌剂对丝绸制品上生长的霉菌和细菌具有良好的抑制作用。
【关键词】丝绸制品；抑菌材料；生物抑菌
丝绸制品在温湿的气候条件下，极容易受到微生物的攻击，使得制品产生霉菌以及细菌，从而影响其使用价值[1-2]。研究表明对丝绸制品破坏作用最大的是藻菌纲的根霉属(Rhizopus Ehrenberg)、子囊菌纲的拟青霉属(Penicilliopsis Solms-Laubach)以及半知菌类的黑曲霉组(A.niger)[2]，而影响最大的细菌是大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。目前研究和应用的丝绸抑菌剂基本是有机合成制剂，其固有的化学特性极容易造成对人体的危害，因此具有一定的应用局限性。由天然植物提取而制成的丝绸纤维生物抑菌剂是经生物处理，既有抑菌功能且对人体无毒害，是当今研究和发展的一个趋势，目前国内外还没有研究和成熟的产品见于报道。因此用于丝绸纤维的生物抑菌研究还是一个空白。
目前世界上具有抑菌活性成分的植物有两千多种。这些植物具有抑菌性好、毒性低、来源丰富和价格低廉等优点，都很有希望成为丝绸抑菌防腐剂开发的资源[3-8]。
1 实验
1.1 材料和仪器
生物抑菌材料：辣木籽、苦参、黄芩、黄柏、地肤子、蛇麻子、土槿皮、山银花、茯苓、火麻仁、大蒜素、穿心莲、金养麦、苦术、黄连。
供试霉菌种：黑曲霉(Aspergillus niger)CGM-CC3.5487。
供试细菌种：大肠杆菌Escherichia coli(8099)革兰氏阴性；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(ATCC 6538)革兰氏阳性。
培养基：
供霉菌试验：察氏液体培养基、察氏培养基、无机盐营养液、无机盐培养基(另添加3 9／6葡萄糖)。
供细菌试验：营养肉汤、营养琼脂、SCDLP液体培养基。
仪器：YP B1003电子天平、B-260恒温水浴锅、CL*3型恒温加热磁力搅拌器、JB90-D强力电动搅拌机、JB-CJ-1F型超净工作台，Autoclavo ES2315型高压灭菌，ZHWY22102型恒温培养箱，SPX 型智能生化培养箱，SPX-2C型显微镜并配摄像设备。
1.2 前期快速抑菌检测方法
为了快速评价生物抑菌材料的实际抑菌效果。我们采用植物胶营养基培养法对生物抑菌材料的抑菌性进行评价。具体方法如下：
将经过抑菌处理的丝绸制品试样埋入瓜尔胶培养基中7天，观察布面变化，并与对照样进行对比。
1.3 抑霉菌检测方法
参照标准：AATCC30*2004测试方法Ⅲ 琼脂平碟，黑曲霉
试样准备：真丝织物经过生物抑菌剂处理后剪下直径为3.8±0.5cm 的圆片。
霉菌孢子液制备：
(1)取无菌水(含0.05 分散剂吐温80)倒入培养好的斜面黑曲霉(Aspergillus niger)菌种中，采用无菌接种环轻刮菌种表面洗出孢子，把孢子液倒入含有玻璃珠的无菌三角瓶内。
(2)用速度4 000r／min离心孢子液，去上清。用50mL无菌水洗涤沉淀后，再离心。用此法清洗3次。这种孢子液用无机盐营养液稀释，采用血球计数板测定孢子含量，孢子液含孢子1×106～5×106个／mL。
接种培养：用涂布棒将1.0±0.1mL的孢子液分散于含3％葡萄糖的无机盐琼脂表面，将圆片置于琼脂表面。用吸管在每个圆片上均匀滴加0.2±0.01mL的孢子液。28±1℃ ，相对湿度RH≥ 95的条件下培养7d。
1.4 抑细菌定性检测方法
参照标准：GB／T20944.1-2007纺织品抗菌性能评价琼脂平皿扩散法
试样准备：真丝织物经过生物抑菌剂处理后剪下直径d=25±5mm 的圆片。
细菌液制备：
(1)用接种环取保存菌，划线接种至营养琼脂平皿，37±1℃培养24h。
(2)挑取典型菌落接种于20mL营养肉汤内，37±1℃，振动频率110/min，培养18～24h。
(3)用无菌蒸馏水20倍稀释营养肉汤，调节菌浓度为1×108～5×108CFU／mL，作为试验用菌液。
抑细菌试验：
(1)准备下层培养基。营养琼脂l0mL／皿。
(2)准备上层培养基。1mL试验菌液加入150mI 营养琼脂培养基，混匀，向(1)中的每个平皿倾注5mL，等其凝结。
(3)用无菌镊子将实验和对照样贴到平皿中央，使试样与琼脂培养基很好地接触。
(4)平皿37±1℃培养18～24h。
1.5 抑细菌定量检测方法
参照标准为：GB／T20944.2-2007纺织品抗菌性能评价琼脂平皿扩散法
试样准备：真丝织物经过生物抑菌剂处理后剪下18mm 正方形，称取0.40±0.05g作为一个试样。进行高压蒸汽灭菌(121℃，103KPa，15min)
抑细菌试验：
(1)试样接种：每小瓶的样品准确接种0.2mI试验菌液。
(2)接种后立即洗脱：在已接种试验菌液的3个对照样小瓶中，分别加入SCDI P培养基20mI，用振荡器震荡5次，5s／次，将菌洗下。
(3)将接种试验菌液的其余小瓶(另外3个对照样和A样、B样、C样抑菌处理的真丝织物各3个)在37±l℃培养18-24h。
(4)培养后洗脱：培养后的小瓶按第2步骤的方法，分别将细菌洗下。
(5)菌落数测定：每个小瓶中取1mI 洗脱液，使用稀释液进行10倍系列稀释，选取合适的稀释度的溶液1mI 注入平皿，再加45～50℃ 的计数平板培养基(EA)混匀，1个稀释度做2个平皿。待培养基凝固后，在37±1℃培养24～48h。培养后，计数出现30～300个菌落平皿上的菌落数(CFU)。若最小稀释度菌落数<30，则按实际的数量记录；若没有菌落生长，菌落数记为“<1”。
(6)结果处理
a.细菌数计算
M = Z×R×20
式中：M 每个试样细菌数；
Z 两个平皿菌落数(CFU)平均值；
R一稀释倍数；20一洗脱液用量(mI )。
b.试验有效性判定
F=lgC1 – lgC0
式中：F 对照样的细菌增长值；
C1一3个对照样接种并培养后测得的细菌数平均值；
C0一3个对照样接种后立即测得的细菌数平均值；
F≥1.5，试验判定为有效；否则试验无效，重新进行试验。
C、抑菌率计算
抑菌率=(C1
– T1 )／C1 ×100%
式中：T1 一3个试样接种并培养后测得的细菌数的平均值；
2 结果与分析
2.1 生物抑菌剂的筛选
为了快速选取具有最好抑菌效果的抑菌材料组成配方。我们采用植物胶营养基培养法对经过生物抑菌剂处理的丝绸制品的抑菌效果进行前期评价，结果如表1。
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表l 不同抑菌剂处理后的丝绸试样抑菌效果 |
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由实验结果可以看出：处理剂2#，4#，5#，7#具有最好的抑菌效果。其中4#是以大蒜素为主
的抑菌材料，具有一定气味不适合丝绸制品的抑菌处理。2#处理剂是由苦参、黄芩、黄柏以及火麻仁等4种天然植物提取物配伍而成，5#处理剂采用辣木籽、茯苓、苦参、黄芩、黄柏、地肤子、蛇床子、土槿皮以及山银花等9种天然植物提取物配伍而成，7#处理剂的组成和5#相同，但7#采用特殊技术进行了提取纯化。
2.2 生物抑菌剂的抑菌效果评价
我们选取2#、5#、7#抑菌处理剂(以下称A样、B样、C样)对其抑霉菌和细菌的效果进行详细的研究。
2.2.1 生物抑菌剂抑霉菌效果评价
我们参照《AATCC30-2004测试方法Ⅲ琼脂平碟，黑曲霉》的检测方法对我们通过前期快速抑菌检测法筛选得到的生物抑菌剂进行了霉菌抑菌效果评价，结果如下。
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图1 抑菌培养结果（反面） |
图2 抑菌培养结果（正面，位置与左图对应） |
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表2霉菌抑菌检测结果 |
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图1，图2以及表2为未经抑菌处理和由抑菌剂A、B、C处理的真丝试样在霉变实验培养7d后霉菌生长情况表。可以发现：未经过抑菌处理的丝绸样布，经过7d的霉菌培养，霉菌在样布表面大量生长.肉眼可观测并且覆盖率达到100％，根据《AATCC-30纺织品的抗真菌能力评估：纺织品抵抗霉变和腐烂能力》标准，属于“宏观增长”的状况。而由抑菌剂A、B处理的真丝样布，霉菌在样布表面有所生长但是覆盖面积较未抑菌处理样布大大减少.相比与未作抑菌处理的空白样来说防霉效果已十分突出.表面覆盖率均小于30％。而由抑菌剂C所处理的真丝织物.在显微镜下仍未见霉菌生长.对比未作抑菌处理的空白样.其抑制霉菌生长的效果十分明显。本实验筛选所得到的抑菌剂具有良好的抑菌能力，能有效地抑制霉菌在真丝织物上生长的能力。
2.2.2 生物抑菌剂抑细菌效果定性评价
我们参照《GB／T20944.1-2007纺织品抗菌性能评价琼脂平皿扩散法》的检测方法对我们通过前期快速抑菌检测法筛选得到的生物抑菌剂进行了细菌抑菌效果定性评价。
2.2.2.1 抑菌圈宽度H值测定
图3为抗菌实验抑菌带，使用游标卡尺进行测定，H=(D-d)／2，结果见表3。
式中 H一一抑菌圈宽度，mm；
D——抑菌带外径的平均值，mm；
d——试样直径，mm。
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图3抗菌实验抑菌带 |
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表3抗菌试验抑菌带宽度 |
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2.2.2.2 细菌繁殖情况测定
抑菌带测定后，用镊子将试样从培养基上移去，用显微镜检查试样接触区域的细菌繁殖情况。可以看出：所有试样下均无细菌繁殖.见表4。
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表4抑菌效果评价 |
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由试验数据可知：对照样抑菌带宽度为0mm。证明对照样不具有抑菌能力，而经过抑菌剂C样抑菌处理的试样抑菌带达到11.57mm(大肠杆菌)和17.17mm(金黄色葡萄球菌)，抑菌剂A样和B样抑菌处理的试样也都有明显的抑菌带，由此可以发现由本实验制得的抑菌剂抑制细菌生长作用明显。
2.2.3 生物抑菌剂抑细菌效果定量评价
我们参照《GB／T20944.2-2007纺织品抗菌性能评价琼脂平皿扩散法》的检测方法对我们通过前期快速抑菌检测法筛选得到的生物抑菌剂进行了细菌抑菌效果定量评价，见表5。
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表5抗菌试验抑菌率 |
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表6抑菌效果评价 |
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由试验数据可知：经抑菌处理的真丝织物.经过两种细菌培养后平均菌落数(CFU)堆本均为零.抑菌率基本均为100％.显示出了良好的抑菌效果。
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图4抑菌效果评价 |
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通过定性，定量两种方法的分析均可证明由本实验得到的抑菌剂抑制细菌生长作用明显.其具有优异的抗真丝织物上细菌生长的能力。
3 结论
(1)通过快速抑菌检测法筛选出辣木籽、茯苓、苦参、黄芩、黄柏、地肤子、蛇床子、土槿皮以及山银花等9种成分复配的生物抑菌剂具有良好的抑制霉菌和细菌在真丝织物上生长的效果。
(2)通过霉菌细菌的培养试验表明：所得到的生物抑菌剂具有良好的抑制霉菌和细菌在真丝丝绸织物上生长的能力。
参考文献：
[1] 李世超,唐长波,异噻唑啉酮类树脂对真丝绸的抗苗整理[J],丝绸,2009(9);29-31,
[2] 唐长波,李世超,污染的丝绸织物cP霉菌的分离与鉴定[J],安徽农学通报,2009,15(17);28-29,
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