载银纤维的抗耐药菌性能研究yd16026
林玲 浙江纺织服装职业技术学院, 浙江宁波315211
收稿日期：2012-12-10
基金项目：宁波市科技局自然科学基金项目《医用载银非织造布的制备、性能及其抗菌模型研究》[项目编号：2011A610111]
作者简介：林玲，女，浙江纺织服装职业技术学院，宁波市先进纺织技术与服装CAD重点实验室，讲师，博士.研究方向：医用功能纺织品研究.
原载: 浙江纺织服装职业技术学院学报 2013/3;1-
【摘要】通过对含有耐氨苄青霉素质粒的转化制备得到了耐药菌，并通过定性和定量试验，介绍了载银纤维的抗菌性能，并结合SEM结果分析了载银纤维的抗菌机理。结果表明该载银纤维对含有耐氨苄青霉素质粒的耐药菌有很好的抑制作用，甚至导致了细菌的膨胀破裂。
【关键词】载银纤维；耐药性；耐药质粒；抗菌性能
【中图分类号】TS101.92 1 文献标识码：C 文章编号：1674.2346(2013)01.0001-04
近年来，随着抗生素和各类抗菌药的使用，耐药菌迅猛发展，而且常为多重耐药菌，对患者的健康和生命构成了严重的威胁，因此，如何控制和减缓细菌耐药性，以及开发针对耐药菌的抗菌材料， 引起了医学界以及其他相关学科研究人员的关注。载银纤维具有优异的抗菌性能[1]，以其低毒、耐药性发生率低等独特优势，被广泛应用于临床，用来治疗各种感染性疾病。因此，我们通过对耐药质粒的转化制备耐药菌，并通过载银纤维对耐药质粒转化的影响，以及对耐药菌的抗菌性能进行了研究，为载银纤维作为耐药菌的抗菌材料奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 抗菌材料与质粒、菌种
载银纤维由深圳洋仟应用技术有限公司提供；耐药质粒为pcDNA3.1(+)／myc-His A (简写：pcDNA3.1)，分子量为5.4kb，带有抗新霉素(Neo1)和氨苄青霉素(Amp1)的标记基因，为青岛大学医学院惠赠；感受态细菌为E.coli DH5a菌株，由上海同济大学医学院惠赠。
1.1.2 试剂和仪器
试剂包括：PBS、Amp抗生素、LB培养液、含Amp抗生素LB培养基。试剂均需高压灭菌。
仪器包括：超净工作台、振荡培养箱、低温离心机、离心管、分光光度计、冰盒、不同型号的枪头、微量移液器、一次性培养皿(美国alpha)、烧瓶等。
1-2 试验方法
1.2.1 银纤维的处理
将单纤维剪成38mm，在紫外灯下灭菌，纤维多次翻动，每次光照30min。
1.2.2 耐药菌的制备(即质粒的转化)[2]
用冷却的无菌吸头从感受态细胞悬液中各取200µl转移到无菌的微量离心管中，每管加入pcDNA3.1 1µl，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟中后放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，不要摇动试管。恰恰90秒后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。然后在每管中加入800µl LB培养液。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细胞复苏。最后将适当体积已转化的感受态细胞转移到含Amp抗生素的琼脂培养基上，等平板置于室温直至液体被吸收后倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后观察到出现的菌落，证实获得了含有pcDNA3.1的耐药菌。
1.2.3 载银纤维对质粒转化的影响
在1.2.2质粒转化过程中，用冷却的无菌吸头从感受态细胞E.coliDH5a菌株悬液中各取200µ1转移到无菌的离心管中，每管加入制备的质粒DNA 1µl，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。在此过程中分别设立对照组和实验组。在实验组中，在离心管内除了加入细胞悬液、质粒DNA外，再加入一定量的载银纤维；对照组微量离心管内仅有细胞悬液和质粒DNA。然后按照1.2.2所述的剩余步骤进行试验。
1.2.4 抗菌定量试验[3-4]
首先将载银纤维在紫外灯下光照灭菌30分钟，然后取细菌平皿中单个菌落与5ml含Amp抗生素营养肉汤中6h成菌悬液。将150mg载银纤维加入到200ml含5％Amp抗生素PBS的三角烧瓶内，加入100µl菌悬液，作为实验组置于恒温振荡器上以300rpm振荡过夜。取0.05ml和O.1ml振荡后的菌液于平皿上，倾注已冷却至50℃以下的含Amp抗生素的LB琼脂，室温至凝固后，倒置于37℃培养箱孵育12-18h，然后进行平皿活菌计数。实验同时设计空白对照组。空白对照组仅含有Amp抗生素PBS和菌悬液。抑菌率计算，采用下列公式计算抑菌率(IR)。
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IR= |
A-B |
×100％ 公式(1) |
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A |
其中A为对照组振荡后平均菌落数，B为测试组振荡后平均菌落数。
1.2.5 载银纤维作用前后耐药菌形态学研究
将耐药菌培养至对数生长期时，接种于100ml LB培养液中培养过夜制得5×108个／ml浓度的细菌悬液。在三角烧瓶内前后加入200ml PBS溶液、5×l08个／ml的细菌悬液及150mg载银纤维，作为试验组，同时设置对照组烧瓶内仅加入200mlPBS溶液和5×108个／ml的细菌悬液。将试验组和对照组置于37℃恒温振荡箱内以220转／分的速率振荡培养过夜后，取样制备标本并在JSM-5600LV扫描电子显微镜下观察，拍照。
2 结果与讨论
2.1 载银纤维对对质粒转化的影响
银纤维对质粒转化的影响如图1所示。
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A为对照组,b,c为实验组 B实验组中加入7.5mg银纤维;c加入15 mg银纤维 图1银纤维的加入对质粒转化的影响 |
从实验结果可以发现，对照组实验中按照正常的转化过程进行所有的步骤，试验细菌悬液倾注的平板中长出了菌群，生长状态良好(见图1 a)。在这些菌株中按照提取质粒的方法提取质粒后进行DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定后发现，这些菌株是携带pcDNA3.1质粒的E.coli DH5a菌株。
另一方面，在进行质粒转化过程中，加入质粒DNA的同时加入了一定量的载银纤维后，其他步骤依正常步骤进行，最后发现加入7.5mg载银纤维后的平板生长的耐药菌明显少于对照组(见图lb)，而加入15mg载银纤维后的平板中已经没有耐药菌的生长(见图1c)。
由这组试验结果可以看出，银纤维的加入对耐药质粒的转化是有一定影响的。虽然我们无法判定，银纤维的加入是抑制了敏感菌还是破坏了质粒的活性。但是，可以肯定的是，银纤维的加入有效地阻碍了质粒的正常转化。
2.2 载银纤维的抗耐药菌性能研究
银纤维对耐药菌的影响可以从图2和表1看出。
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A、b为对照组，c、d为实验组， a、c为0.1ml； B、d为0.05ml作用后细胞悬液注琼脂搬弄是非的平板 图2 抗耐药菌定量试验 |
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表1 银纤维对耐药菌pcDNA3.1-B coli DH5a菌株的抑菌率 |
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对照组试验组中的平板中生长有耐药菌，并且从0.05ml和0.1ml琼注液的数据可以看出细菌生长情况正常。试验组中在耐药菌肉汤中加入15mg银纤维后取肉汤并琼注后进行培养，结果从图2c和d以及表1中可以看出，已经没有耐药菌的生长了。15mg镟纤维(即75µg/ml)的加入完全抑制了耐药菌在培养基中的生长。
2.3 载银纤维作用前后耐药菌的形态比较
为了进一步验证载银纤维对耐药菌的抑制作用，我们研究探讨了银纤维对pcDNA3.l-E．coli DH5a菌株的形态学影响，其观察结果如图3和图4所示。
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图3 正常耐药菌的形态 |
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图4 银纤维作用后耐药菌形态 |
扫描电镜下对照组pcDNA3.1-E．coli DH5a菌株细胞边缘丝齐轮廓消晰，菌体表面光滑，呈均匀的杆状，异常形态大肠埃希菌细胞未能观察到(图3)，而经银纤维处理后。pcDNA3.1-E Coli DH5a菌株表现为细胞边缘不整，轮廓模糊，菌体形态变短变粗，菌体膨胀甚至出现细胞破裂，异常菌体形态增多(图4)。
从实验结果，我们发现pcDNA3.1-B coli DH5a菌株是由菌体的两端开始破裂的，之后逐渐往菌体中间部分破裂开去。这是因为pcDNA3.1-E．coli DH5a菌株是大肠埃希菌，属于杆菌，可能是因为电荷分布不均匀而引起的杆菌两端首先开始崩裂。
形态学研究是观察正常及病变细胞的结构变化的简单易行的实验方法。菌体表面形态学变化是菌体内部结构及机能的变化的一种直观表现。从这组试验结果来看，银纤维对pcDNA3.1-E.coli DH5a菌株的作用是一个菌体逐渐变粗变短，直至菌体完全破裂的过程。这也就能说明，银纤维能够导致pcDNA3.1-E.coli DH5a菌株正常形态结构的改变，主要反映在细胞表面的异常变化。
3 结论
通过对耐药质粒进行转化制备得到了耐药菌，并通过载银纤维对质粒转化的影响及其抗耐药菌性能及作用前后形态学分析来观察银纤维对耐药菌的影响，从而得出以下结论：1)通过对质粒转化过程的影响实验，我们发现加入银纤维后质粒转化过程失败；2)通过抗pcDNA3.1-E.coliDH5a耐药菌株的定量试验，得出银纤维对pcDNA3.1-E.coliDH5a耐药菌株有很好的抑制作用；3)通过银纤维作用前后pcDNA3.1.E.coli DH5a耐药菌株的形态学变化分析，我们可以发现，银纤维的加入使得耐药菌株膨胀而破裂。
参考文献
[1]林玲，龚文忠，王国华，等.银纤维的抗菌性能研究[J]上海纺织科技，2010，38(1)：42-43.
[2] 萨姆布鲁克，D.w 拉塞尔.分子克隆试验指南(第三版)[M]黄培堂，译.北京：科学出版社，2002
[3]卫生部.消毒技术规范[s].北京：中华人民共和国卫生部，1999.
[4]倪语星.微生物学和微生物学检验试验指导[M].北京：人民卫生出版社，2001：25.