碱性果胶酶菌种选育及在纺织前处理中的应用研究yd12006

吴茜 沈雪亮 汪钊    浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014

原载：第八届全国染整前处理学术研讨会论文集（2009）；352-354

 

    【摘要】从土壤及腐败的水果中筛选到一株产碱性果胶酶酶活高的菌株，经过初步鉴定为芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp.WZ008，经发酵，酶活可达到42 U／mL，酶的最适作用条件为pH值9.6，60℃.纺织前处理中最适使用温度55℃。适合用作纺织酶制剂。Ca2+对酶活有明显的促进作用，用自制碱性果胶酶处理纱布，可达到织物处理要求，且效果优于商品酶。

【关键词】碱性果胶酶；芽孢杆菌：织物：前处理

 

    果胶酶是一类能分解植物组织中果胶质的酶系，碱性果胶酶是指在碱性范围内具有较高活性的果胶酶，目前广泛用于织物处理、植物纤维脱胶、造纸、纯化植物病毒等方面[1]。传统的棉织物精练加工是在高温、强碱条件下进行的，既不利于环保，对织物损伤也较大.而用碱性果胶酶处理织物。由于酶的专一性且作用条件温和，具有对织物损伤小，对环境污染少的优点.碱性果胶酶可由细菌、放线菌、真菌产生，但具有工业化应用前景的菌种并不多，仅有嗜碱芽孢杆菌[2]、螺胞菌[3]等几种。本试验从土壤及腐败的水果中分离筛选到了一株碱性果胶酶的高产菌株，初步考察了自制碱性果胶酶在纱布精练加工中的应用效果。

1  试验

1.1  试剂

  果胶(pectin)，Sigma公司：纱布，上海川本卫生材料有限公司秀洲分公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2  培养基组成

    富集培养基：桔皮粉20g/L：葡萄糖1Og/L；牛肉青5g/L；NaCl5g／L：K2HP04 l／L；KH2P0 40.3g/L；pH8.5.初筛培养基：果胶5g/L：牛肉膏3g/L；蛋白胨10g/L：NaCl 5g/L；琼脂15-20g/L；pH8.5.斜面保藏培养基：牛肉膏3g/L；蛋白胨10g/L：NaCl 5g／L；琼脂15-20g／L：pH8.5, 种子培养基：牛肉膏3g/L：蛋白胨10g／L；NaCl 5g／L：pH8.5; 发酵培养基：麸皮10g/L：果胶6g/L；蛋白胨1.5g／L，碳酸钙5g/L；pH7.5。

1.3  菌种筛选

    富集培养：将从湖北、浙江各地果园中选取的适量土壤放入盛有无菌生理盐水带玻璃珠的三角烧瓶中制成土壤悬液.将一些含果胶质高的腐败水果表皮以及土壤悬液分别放入富集培养基中，30℃，200r／min培养2 d，得一次富集液.再取适量一次富集液加入到富集培养基中，30℃，200r／min培养2 d，得二次富集液.初筛：将富集培养液离心，稀释得梯度稀释液，涂布于初筛培养基平板上，放入30℃培养箱中培养24h.并在平板上倒入少量十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，静置10 min，观察并测量菌落周围出现透明圈的直径(Dp)和菌落直径(Dc).挑取Dp／Dc值较大的菌落，保藏于斜面。

    复筛：将初筛得到的菌株接种到种子瓶，用250ml三角瓶装30mL培养基，30℃，200 r／rain培养24 h.再将种子液以10％(体积分数)的接种量接入到发酵培养基，用500mL，三角瓶装30mL培养基，30℃，200 r／rain培养24h离心取上层清液测酶活。

1.4  织物处理工艺

    酶精练：沸水预处理30 min[4]→酶精练(55℃，120min，pH9.6，浴比1:20) →热水洗→冷水洗→烘干(105℃),碱精练：沸水预处理30min→碱精练(NaOH 10％owf，肥皂2 g／L，100℃，120 min，浴比l:20) →热水洗→冷水洗→烘干(105℃，lh)。

1.5  分析方法

酶活测定：取1mL适当稀释的粗酶液和2～ml l％(质量分数)果胶溶液(pH9.6)分别置于两个试管中，于55℃水浴预热5min，再使它们充分混合，准确反应10min.取反应混合物l mL加入9mL 0.0lmol／L HCl终止反应，在235nm处测定吸光值，以灭过酶活的酶液作为空白对照，一个标准酶活单位(IU)定义为：1min使果胶裂解产生lμmol不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数为4600L／mol-cm[5]；织物减量率(m1.m2)/ml×100％，其中ml为未处理的织物恒定质量(g)：m2为经酶处理的织物恒定质量(g)：润湿性：按AATCC79.1979测定：织物上裂解的不饱和聚半乳糖醛酸量(μmol／g)：取处理织物后的反应液l mL，加入9 mL 0.01 mol/L，HCl，在235nm处测定吸光值，以灭过酶活的酶液作为空白对照.

2  结果与讨论

2．1  菌种筛选与鉴定

    菌种筛选：从多份土壤以及腐败的水果中选择圈径比大的菌落，初筛到19株细菌、2株霉菌．通过复筛，筛选到一株产酶较高的细菌。菌种鉴定：筛选到的菌株培养24h后，菌落呈乳白色，圆形，显微镜下观察为杆状．革兰氏染色为阳性，有芽孢，大部分为中生。根据<伯杰氏系统细菌学手册>描述特征，该菌株属于芽孢杆菌，暂定名为Bacillussp．WZ008．摇瓶产酶：将种子液以10％(体积分数)的接种量接入到发酵培养基中，用500 mL三角瓶装30 mL培养基，30℃，200 r／min培养，定时取样，考察培养时间对产酶的影响。图l结果表明，菌株在12-24h之间酶活力迅速升高，在60h进入产酶高峰期，酶活可达到42U／mL，随着时间的延长，产酶水平有所下降。

图1碱性果胶酶产酶进程

2．2  酶学性质

2．2．1  最适作用pH及pH稳定性

    将酶液分别加入到用pH 8．0-10．6的甘氨酸，氢氧化钠缓冲液、pH 11．0的磷酸氢二钠，氢氧化钠缓冲液配制的果胶溶液中，测定酶活力。图2结果表明：此酶的最适pH为9．6．将酶在不同缓冲体系中55℃水浴保温l h后测其酶活。结果表明：在最适pH 9．6的条件下，酶活力仍可保持在80％以上。

图2酶的最适作用pH及pH稳定性

2．2．2  最适作用温度及温度稳定性

    图3结果表明，酶的最适作用温度为60℃，在55℃条件下可保持90％以上的活力，65℃条件下可保持80％以上的活力，70℃时，酶的活力迅速下降。

图3酶的最适作用温度

    由于碱性果胶酶在纺织前处理工艺中的反应时间一般在lh左右，因此，研究酶的热稳定性就显得非常重要．在55℃和60℃条件下，分别测定保温30-180min后的酶活。图4结果表明，碱性果胶酶在55℃条件下的热稳定性优于60℃。保温lh后，55℃条件下仍能保持70％以上的活力。而60℃条件下只有近50％的活力．保温3h后。55℃条件下仍有50％以上的活力，而60℃条件下只剩下10％的活力．因此，在纺织前处理工艺中，宜选择在55℃条件下处理织物。

图4酶在55℃和60℃条件下的热稳定性

 2．2．3金属离子对酶活力的影响

    各种金属离子对碱性果胶酶酶活的影响见图5。

金属离子mmol/L

    在酶反应体系中分别加入CaCl2、MgS04·7H20，CuS04，ZnCl2，FeSO4·7H20，MnCl2·4H20，使其最终浓度为lmmol／L，考察它们对酶活力的影响．图5结果表明，Ca2+对酶活有明显的促进作用，Mn2+对酶活有一定的抑制作用，其他金属离子对酶活没有明显影响．碱性果胶酶需要Ca2+作为激活剂，研究碱性果胶酶结构时发现有Ca2+的结合位点。[6]

2．3  织物处理

    由表l可以看出，从毛效与织物上裂解的不饱和聚半乳糖醛酸量两个指标来看，酶精练与碱精练效果相当，达到织物处理要求．从减重率来看，酶精练要低于碱精练，说明酶法处理对织物的损伤小。从手感来讲，酶精练的柔软度也优于碱精练。

表1  酶精练与碱精练效果对比

处理工艺

酶活

(Um/L)

减重率

％

毛效

／cm/(30min)

A

／(μmol/g)

诺维信酶2％(体积分数)

3．75

1．16

7．5

3．99

自制碱性果胶酶

4．26

1．59

8．0

5．44

碱精练

 

3．27

7．3

4．79

注：A为织物上裂解的不饱和聚半乳糖醛酸量。

    用自制碱性果胶酶处理的织物，其润湿性、果胶去除量均略优于诺维信酶．说明自制碱性果胶酶可以代替诺维信酶用于棉织物处理。

3   结论

(1)从土壤及腐败的水果中筛选到一株产碱性果胶酶酶活高的菌株，经初步鉴定为芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp．WZ008。经发酵，酶活可达到42U／mL．。

(2)用自制碱性果胶酶处理纱布，可达到织物处理要求，且效果优于商品酶．

参考文献

 [1] H00NDAL G S，TTYWARI R P，TEWARIR，et a1．Microbial alkalinepectionases and their industrial applications：a review[J]App1．Microbi01．Biotechno1．，2002，59：409-418．

 [2]CAO J，ZHENG L，CHEN S．Screening of pectinace producer from alkalophilicbacteria and study on its potential application in degumming of ramie[J]Enzyme Microb．Techno1．，l992，14：1010-1016

 [3]钟卫鸿，王启军，岑沛霖．螺胞菌ZC0901的筛选及其产碱性果胶酶发酵条件研究[J]应用与环境生物学报，2000．6(5)：468-472

 [4]WANG Q,FAN Xue-Rong，HUA Z Z，et a1,Optimizing bioscoming conditionof cotton knitted fabrics with an alkaline pectinase from bacillussubfilis WSHb04．02 by using response surface Method ology[J]．Biochemical Engineering Journal，2007，34：107．113．

 [5]TATSUJI S，ROQUE A H，TAKUO S．Purification，characterization and production of two pectic transeliminases  with  photopectinase activity from bacillus subtilis[J]．Biosci．Biotech,Biochen，1994，58：353．358．

 [6]HERRON，RICHARD S．A sturtural and kinetic understanding of theenzymatic mechanism of the pectate lyases[D]．Irvine：University of California，2001．